原位雜交方法
日期：2025-05-08 21:44
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摘要：
原位雜交是在分子生物學領域應用極為廣泛的實驗技術之一，是在研究生物體發育過程中的一種極為重要的分子遺傳學的研究方法。其英文名為insitu hybridization,其中in situ為拉丁文，原義是"in its natural position".字面的意思理解就是說在其原來的天然的位置處雜交。
原位雜交主要是基于以下這個主要原理：單鏈的DNA或者RNA只要他們的序列是互補的，即符合AT，CG的堿基配對原則，那么這樣的兩條核酸鏈之間（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一個穩定的雜交復合體。這一原理對于檢測一個特異的mRNA在某一種生物體，或者某些組織切片、單個細胞里具體表達位置非常有用。該技術*早應用于60年代末期，由于核酸分子雜交的特異性高，并可**定位，因此該技術已被廣泛應用，例如與細胞內RNA進行雜交以觀察該組織細胞中特定基因表達水平。
原位雜交能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對于那些細胞數量少且散在于其他組織中的細胞內DNA或RNA研究更為方便；同時由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細胞的形態，更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態。核酸原位雜交可根據其檢測物而分為細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交；根據其所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經過組織細胞的固定，預雜交，雜交，沖等一系列洗步驟及放射自顯影或**酶法顯色以顯示雜交結果。我們在這兒介紹的是整胚原位雜交，不同于一般的在載片上對細胞和組織切片進行探針雜交及檢測的原位雜交，而是對完整的斑馬魚胚胎進行探針雜交及檢測，從整體上把握探針的結合部位，然后對胚胎進行切片，以確定探針結合的具體位置。整胚原位雜交在斑馬魚分子生物學研究中是一種非常重要的實驗方法，原位雜交的探針可以是同位素的探針，用放射自顯影來檢測；也可以是非同位素的探針，通過熒光或酶法予以檢測。我們這兒所介紹的一種原位雜交的方法是通過后者，以地高辛標記探針，然后用酶聯抗體的方法進行檢測。
原位雜交（In situ hybridazation）
收集斑馬魚的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發育時期時，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成）
一. 原位雜交第**
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
2） 置換成30％甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次
4） 置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定環節
1）用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織，以便于雜交。
2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫
2. 預雜交
1）每個管中置換成大約300ulHYB－溶液，Thermobrite原位雜交儀60℃5分鐘，避免振蕩
2）用等體積的HYB＋取代HYB－。
3）Thermobrite 原位雜交儀60℃預雜交4小時以上。
3. 雜交
1）吸去預雜交的HYB＋，加上100ul已加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）.
2）Thermobrite原位雜交儀60℃ 溫浴過夜。
注：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。
二. 原位雜交**天
首先
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置30分鐘，重復一次。
3）置換2XSSCT1ml，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置30分鐘，重復一次
**
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動。
2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時間為一小時
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過夜。
三. 原位雜交第三天
1）用1ml含10％熱滅**清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時以上，*后用1mlMABT溶液置換，25分鐘
2） 用1ml 1mM**米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘
3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple APSubstrate(底物，用之前加5mM**米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，室溫下顯色
4）每隔一小時觀察胚胎是否開始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照
6）4C冰箱保存
儀器配置：
原位雜交中溶液的配制：
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 調PH值至7.4 后 抽濾，**
4% 多聚甲醛多聚甲醛：40g PBS 1L 加熱持續攪拌至溶液澄清，-20℃保存。
PBST：PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2g NaCl 175.5g DEPC H2O 至1L 抽濾，**
SSCT:SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB:甲酰胺：20XSSC儲液：
DEPC水=2：1：1配制
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存
HYB+：HYB- 20ml;yeast RNA 10mg
原位雜交主要是基于以下這個主要原理：單鏈的DNA或者RNA只要他們的序列是互補的，即符合AT，CG的堿基配對原則，那么這樣的兩條核酸鏈之間（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一個穩定的雜交復合體。這一原理對于檢測一個特異的mRNA在某一種生物體，或者某些組織切片、單個細胞里具體表達位置非常有用。該技術*早應用于60年代末期，由于核酸分子雜交的特異性高，并可**定位，因此該技術已被廣泛應用，例如與細胞內RNA進行雜交以觀察該組織細胞中特定基因表達水平。
原位雜交能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對于那些細胞數量少且散在于其他組織中的細胞內DNA或RNA研究更為方便；同時由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細胞的形態，更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態。核酸原位雜交可根據其檢測物而分為細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交；根據其所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA, RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪種雜交都必須經過組織細胞的固定，預雜交，雜交，沖等一系列洗步驟及放射自顯影或**酶法顯色以顯示雜交結果。我們在這兒介紹的是整胚原位雜交，不同于一般的在載片上對細胞和組織切片進行探針雜交及檢測的原位雜交，而是對完整的斑馬魚胚胎進行探針雜交及檢測，從整體上把握探針的結合部位，然后對胚胎進行切片，以確定探針結合的具體位置。整胚原位雜交在斑馬魚分子生物學研究中是一種非常重要的實驗方法，原位雜交的探針可以是同位素的探針，用放射自顯影來檢測；也可以是非同位素的探針，通過熒光或酶法予以檢測。我們這兒所介紹的一種原位雜交的方法是通過后者，以地高辛標記探針，然后用酶聯抗體的方法進行檢測。
原位雜交（In situ hybridazation）
收集斑馬魚的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發育時期時，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成）
一. 原位雜交第**
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
2） 置換成30％甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次
4） 置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。
蛋白酶處理與后固定環節
1）用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織，以便于雜交。
2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫
2. 預雜交
1）每個管中置換成大約300ulHYB－溶液，Thermobrite原位雜交儀60℃5分鐘，避免振蕩
2）用等體積的HYB＋取代HYB－。
3）Thermobrite 原位雜交儀60℃預雜交4小時以上。
3. 雜交
1）吸去預雜交的HYB＋，加上100ul已加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）.
2）Thermobrite原位雜交儀60℃ 溫浴過夜。
注：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。
二. 原位雜交**天
首先
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置30分鐘，重復一次。
3）置換2XSSCT1ml，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，Thermobrite原位雜交儀60℃，放置30分鐘，重復一次
**
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動。
2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時間為一小時
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過夜。
三. 原位雜交第三天
1）用1ml含10％熱滅**清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時以上，*后用1mlMABT溶液置換，25分鐘
2） 用1ml 1mM**米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘
3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple APSubstrate(底物，用之前加5mM**米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，室溫下顯色
4）每隔一小時觀察胚胎是否開始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照
6）4C冰箱保存
儀器配置：
原位雜交中溶液的配制：
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 調PH值至7.4 后 抽濾，**
4% 多聚甲醛多聚甲醛：40g PBS 1L 加熱持續攪拌至溶液澄清，-20℃保存。
PBST：PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
20XSSC:Na3Citrate 2H2O 88.2g NaCl 175.5g DEPC H2O 至1L 抽濾，**
SSCT:SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。
HYB:甲酰胺：20XSSC儲液：
DEPC水=2：1：1配制
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存
HYB+：HYB- 20ml;yeast RNA 10mg